INTRODUCCIÓN.
un organismo debe ser capaz de replicarse, es decir, dejar constancia de su existencia a través de la transmisión de su información. Por tanto, cada organismo posee unas instrucciones sobre su descripción completa que debe de transmitir a la siguiente generación. Pero esta información solo es útil si existe un mecanismo para expresarla, es decir, que se manifieste dando lugar a todo una gama de estructuras responsables de las diferentes formas de los organismos vivos.
Los ácidos nucleicos es una de las cuatro familias macromoleculares, que si bien no es importante desde el punto de vista cuantitativo, ya que representan una mínima parte de la masa de un organismo, su importancia cualitativa es enorme, ya que en ellos reside, en forma de código, la información necesaria para la síntesis de la enorme variedad de proteínas de los organismos. En efecto, ácidos nucleicos como al ADN constituyen el llamado material hereditario, es decir, este tipo de moléculas albergan toda la información necesaria para un organismo. Por otra parte, otros ácidos nucleicos como los distintos tipos de ARN, intervienen en la formación y estructura de los ribosomas, transportan aminoácidos al ribosoma e indican la composición en aminoácidos de las nuevas proteínas.
2. ÁCIDOS NUCLEICOS.
El ADN es la sustancia portadora de la información genética del organismo, es decir, de las instrucciones mediante las cuales cada nuevo ser plasma, en el curso de su desarrollo ontogenético, los caracteres que le corresponden según su especie.
El ARN es la sustancia encargada de la ejecución de dichas instrucciones. El acto primario de este fenómeno es la síntesis de las proteínas específicas, incluyendo entre éstas las enzimas. Esta síntesis es la misión del ARN
En relación con estas dos funciones tan diferentes, está la distribución de uno y otro ácido en las células, y la cantidad relativa de los mismos. El ADN se encuentra en el núcleo y en una pequeña proporción en mitocondrias y cloroplastos. El ARN se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma.
2.1. Historia de su descubrimiento e investigación
Miescher analizó la nucleina y descubrió lo que más tarde se llamaría ADN. La importancia de los acidos nucleicos fue enmascarada por la gran importancia que se dieron a las proteínas en épocas pasadas. No se vio hasta muy adelante su papel en el transporte de la información. Era éste un valor que se atribuía a las enzimas, ya que sus propiedades catalíticas casaban mejor con las ideas de entonces sobre la sustancia controladora de los procesos hereditarios y evolutivos.
Astbury estudió el proceso de replicación de los genes, y había creído poder explicar el secreto de la autoduplicación de los cromosomas atribuyendo el inicio de la vida a una interacción entre proteína y ácido nucleico, pero seguía creyendo que los constituyentes de los genes eran las proteínas.
Avery observando la transmisión de modificaciones hereditarias nuevas en cultivos de neumococos, identificara al ADN como sustancia responsable de la transmisión hereditaria.
Chargaff comprobó bioquímicamente la transmisión de la herencia mediante el ADN de E.coli. profundizó de manera notable en la discusión sobre la estructura molecular del ADN, que desde comienzo de nuestro siglo había sido presentado como un tetranucleótido compuesto por restos de ácido desoxiladenílico, desoxicitidílico, desoxiguanílico y desoxitimidílico.
Señaló que las cuatro bases guanina, citosina, timina y adenina pueden estar ordenadas en un polinucleótido en una secuencia cualquiera y que el contenido relativo de cada una de las bases mostraba una sorprendente regularidad, Chargaff destacó como algo especialmente notable que en todos los ADNs estudiados las proporciones molares del total de adenina respecto a timina y de guanina respecto a citosina son igual a 1.
Estas ideas de Chargaff sobre su agrupamiento regular por pares inspiraron a Watson y Crick en su análisis de la estructura molecular.
Por medio de estudios de cristalografía radiológica idearon la estructura de la doble hélice del ADN, cuyas cadenas individuales están unidas por las pares de bases y, finalmente, a explicar la replicación idéntica de los genes y el proceso químico de la síntesis de proteínas de Jacob y Monod. Estos descubrimientos señalaron la nueva orientación de la biología y el despegue de la genética molecular. En el 62 se le concede a Watson Y Crick el premio Nobel por su innovadora comprensión de la importancia genética de la estructura del ADN.
En la actualidad la principal fuente de inseguridad que subyace a los experimentos biológicos moleculares reside en la falta de comprensión de la naturaleza de los mecanismos de control de la lectura de la información genética o de su transmisión mediante el ARNm, en el nivel molecular pero también en que implican posibilidades de abuso.
2.2.Composición química
Los ácidos nucleicos son polímeros formados por unidades repetitivas. La hidrólisis completa pone de manifiesto tres componentes principales: un azúcar, bases nitrogenadas y ácido fosfórico. El azúcar es una pentosa, la D-ribosa en el caso del ácido ribonucleico y la 2desoxi-D-ribosa en el ácido desoxirribonucleico. Ambos toman el nombre del azúcar que los componen. Las bases nitrogenadas son la principal característica de las unidades del polímero del ácido nucleico, los nucleótidos, y los identifican y diferencian, ya que son la parte reactiva de los nucleótidos.
Los dos tipos de ácidos nucleicos tienen las mismas bases púricas, derivadas de la purina que son la adenina ó 6-aminopurina y la guanina, 2-amino-6-hidroxipurina. Existen otras bases púricas que aparecen en menor proporción tales bases son la hipoxantina, xantina, 2-metil-adenina, 6-metil-aminopurina.
Las bases pirimidínicas, derivadas de la pirimidina son la timina también llamada 5-metiltiouracilo, el uracilo, 2,6-dihidroxipirimidina y la citosina (2-hidroxi-6-pirimidina). Esta última es común al ADN y al ARN, mientras que la timina solo aparece en el ADN y el uracilo en el ARN. En ocasiones, se encuentran también la 5-metilcitosina
Base + azúcar= nucleósido + ortofosfórico = nucleótidos.
La terminología que se emplea es la siguiente:
Los nucleósidos y nucleótidos pueden existir en forma desoxi o hidroxi, según que el azúcar sea la desoxirribosa o la ribosa respectivamente. En el primer caso se antecede la denominación con el prefijo d. Además, todos los nucleótidos pueden tener 1,2 o 3 grupos fosfatos ligados al carbono en posición 5′, dando lugar a los nucleósidos monofosfatos (NMP), difosfatos (NDP) o trifosfatos (NTP). De acuerdo con lo anterior, las denominaciones abreviadas de los nucleótidos serán por ejemplo ATP para el adenosín trifosfato, dGMP para del desoxiguanosín monofosfato, etc.
También es posible que el grupo fosfato esté ligado al carbono 3′ en lugar del 5′, denominándose nucleósido-3′-monofosfato y nucleósido-5’monofosfato respectivamente.
3. ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)
Como se ha indicado anteriormente, está compuesto por desoxirribosa, ácido fosfórico y bases púricas o pirimidínicas, mayoritariamente adenina, guanina, citosina y timina.
3.1.Propiedades físico-químicas
– Peso molecular: es muy elevado. Se determina por difusión de la luz o por medida de la constante de sedimentación y de la viscosidad intrínseca. Por ejemplo, el ADN de Escherichia Coli, mide 1 mm y contiene 4 x 106 pares de nucleótidos con un peso molecular de 2 x 109. En las células superiores la cantidad de ADN es enorme. El espermatozoide 109 pares de nucleótidos longitud total de 1 metro.
– Solubilidad: Las sales sódicas de ADN son solubles pero las soluciones obtenidas presentan una viscosidad muy elevada. El ADN precipita en las soluciones salinas diluidas por adición de dos volúmenes de etanol.
– Absorción: El ADN absorbe la luz en el ultravioleta, debido a la presencia de las bases púricas y pirimidínicas, en la zona de 260 milimicras. La degradación molecular provoca un efecto hiper-crómico.
– Temperatura. Cuando se calienta una solución acuosa de ADN, se observa un aumento de la densidad óptica a 260 milimicras y una disminución de la viscosidad, lo que se corresponde a la separación de las cadenas o hebras. Debido a que los enlaces guanina-citosina son más estables que los timina-adenina, el punto de fusión será tanto más elevado, cuanto mayor sea el contenido en las dos primeras bases. Si después de la elevación térmica se refrigera la solución, pueden suceder dos cosas: si el enfriamiento es rápido, las dos cadenas permanecen separadas y el ADN se ha desnaturalizado irreversiblemente. Por el contrario, si el enfriamiento es lento, las dos cadenas se reaparean, reconstituyendo la doble hélice inicial. Este proceso es más evidente y fácil de realizar en células bacterianas que en eucariotas.
3.2.Estados naturales del ADN
El ADN en los seres vivos se puede encontrar en los siguientes estados naturales:
– ADN de virus: los virus son elementos infecciosos y complejos, organizados y parásitos. Se encuentran constituidos por una fracción periférica, la cápside constituida por subunidades o capsómeros que están formados por proteínas que rodea a un elemento central ADN o ARN. Existen numerosos virus cuyo ácido nucleico es ADN. En los más pequeños, los bacteriófagos, en realidad no existe más que una molécula de ADN bicatenario. el fago T2sería un ejemplo. Casi todos son bicatenarios, aunque se han encontrado algunos monocatenarios, como el fago ΦX174
– ADN de organismos procarióticos: En general está formado por una doble hélice de forma circular, replegada gracias a su carácter vermicular y altamente compacta, está desnudo, no unido a proteínas, por lo que es muy accesible, propiedad que se ha empleado para el estudio intensivo de estas moléculas. En las mitocondrias, presentes en células eucarióticas, el ADN se encuentra presente en forma de 4-6 moléculas bicatenarias y circulares, siendo similar al ADN bacteriano.
– ADN de organismos eucarióticos: El ADN de las células eucarióticas se presenta en forma de largas cadenas, estrechamente unidas a proteínas básicas, las protaminas y las histonas básicas. Las proteínas se enrollan alrededor de la doble hélice, los grupos aminos de los aminoácidos básicos neutralizan las funciones ácidas libres del ADN, ya que los grupos fosfato ocupan una posición externa sobre la doble hélice. Los aminoácidos no básicos de las proteínas quedan excluidos de estas interacciones, formando unos bucles que «erizan» la molécula de ADN. Esta combinación de proteínas y ADN forman la denominada cromatina que en estado de división celular se encuentra constituyendo unidades discretas, los cromosomas, donde el ADN se encuentra muy enrollado. Tanto el número como la forma de estos cromosomas son característicos de la especie considerada.
3.3. Estructura molecular del ADN
La proporción relativa de A+T/G+C=1 es una de las propiedades de la molécula de ADN. Por una parte, un mayor contenido en G+C implica una mayor estabilidad y por otra hay una correlación lineal entre este contenido y la densidad, determinada en un gradiente de densidad.
El análisis químico del ADN había determinado pues que se trata de un polímero, construido por muchos nucleótidos -polinucleótido- y mediante la difracción de rayos X se han determinado las principales características estructurales del ADN. Las bases nitrogenadas, que son estructuras planas, están orientadas perpendicularmente al eje del polinucleótido y están dispuestas unas encima de otras, apiladas con una separación de 3,4 angstrom. El polipéptido no es una cadena recta, sino que está enrollada helicoidalmente alrededor de un eje central. Una vuelta o espiral completa de la hélice supone un avance de 34 angstrom y el diámetro constante de la hélice es de 20 angstrom
Por fin, con los datos químicos disponibles y la difracción de rayos X J.D.WATSON y F.H.C.CRICK establecieron que la estructura del ADN tiene dos cadenas helicoidales enrolladas alrededor del mismo eje. Cada cadena consiste en grupos fosfato diéster que unen residuos betaD-desoxirribosa con ligamientos 3′,5′. Las dos cadenas, aunque no sus bases, están relacionadas por una diada perpendicular al eje. Ambas cadenas son hélices dextrosas, pero las secuencias de las moléculas van en direcciones opuestas. Los planos del azúcar y de la base nitrogenada unida a ella son prácticamente perpendiculares. Cada dos residuos adyacentes de una cadena forman un ángulo de 36 grados, de manera que la estructura se repito cada 10 residuos en cada cadena, siendo las bases las que mantienen juntas las cadenas mediante enlaces de hidrógeno entre pares de bases, una de cada cadena. Un miembro del par es una base púrica y la otra pirimidínica. Los enlaces se establecen entre las posiciones 1-1 y 6-6 y en el par guanina-citosina interviene además la posición 2.
Las bases aparecen en configuraciones cetónicas más frecuentemente que enólicas y su apareamiento es específico: adenina con timina y guanina con citosina y su secuencia en cada cadena no parece sometida a ninguna restricción.
Las dos cadenas polinucleotídicas que constituyen la doble hélice son complementarias y de direcciones opuestas, son antiparalelas, teniendo una de ellas la dirección 5′-3′ mientras que la otra toma la dirección 3′-5′. Se conocen algunas excepciones, como la representada por el ADN del fago 0X174 que presenta configuración helicoidal monocatenaria.
3.4. Funciones biológicas del ADN
Si consideramos la molécula de ADN, parece difícil que pueda ser reactiva, ya que la disposición de las bases, que son los elementos variables, hacia el interior sugiere una estructura destinada a proteger la información, más que a participar en reacciones bioquímicas. No obstante, la doble hélice es capaz de adoptar muchas formas y de reaccionar de diversas maneras con otras moléculas celulares. Estas características son aprovechadas por las células para controlar la expresión de la información contenida en el ADN.
La secuencia repetitiva recíproca, en la que a una secuencia dada en una fibra le sigue su secuencia complementaria en orden inverso. Si las fibras que componen la doble hélice están separadas puede formarse en cada una de ellas una estructura local de bases apareadas parecida a una horquilla, ya que esta circunstancia forzosamente se da en ambas fibras y la estructura entera adquiere un aspecto cruciforme. Estos tipos de estructura pudieran servir como señales de reconocimiento.
El ADN actúa como fuente de información mediante su interacción con una serie de proteínas. Unas lo copian en ARN mientras que las otras modulan la actividad copiadora. En el proceso de transcripción, las ARN polimerasas elaboran una copia de ARN de una de las hebras del ADN, la cadena codificadora. Parte de este ARN desempeña misiones estructurales y otra parte se convierte en ARN mensajero. En cualquier célula debe decidirse qué genes se transcriben a ARN-m (expresarse) y cuándo. La mayor parte de ese control se ejerce en la fase de unión de la ARN polimerasa. La polimerasa inicia su acoplamiento a secuencias específicas que preceden a cada gen o agrupamientos de genes; se trata de la región «promotor». Existen varios mecanismos para la unión de la polimerasa, como su inhibición si en el lugar de unión se encontrara una proteína, o bien si se altera la secuencia local del ADN. Asimismo, favorecerían la unión diversos tipos de cambios en la estructura riel ADN así como la unión a proteínas reguladoras lo suficientemente cercanas como para interactuar favorablemente y estabilizar la unión. Los organismos recurren a todas estas estrategias para regular la actividad génica. Los mecanismos de regulación precisan de secuencias específicas y de gran número de proteínas para reconocerlas. La regulación de la transcripción se efectúa fundamentalmente por tres mecanismos principales: proteínas reguladoras (operón), superenrollamiento o la metilación de la citosina.
Se ha observado que las enzimas de restricción o restrictasa reconocen de forma específica secuencias breves de bases en el ADN, escindiéndolo por esos lugares. Una de las modificaciones que parecía influir en la actividad restrictasa era la metilación de la adenina y de la citosina. Esta metilación tiene lugar inmediatamente después de la replicación del ADN por enzimas que tienen la misma especificidad sobre las secuencias que las restrictasas.
La 5-metilcitosina constituye un componente común del ADN de células eucariotas. Su presencia condiciona la actividad génica actuando como una señal que facilita la actividad a inhibición de los genes. La metilación de las regiones reguladoras se halla generalmente asociada a la inactivación génica, ya que la 5-metilcitosina bloquea la unión de los activadores transcripcionales o estimula la acción de inhibidores.
El patrón de metilación del ADN se transmite de una célula a su hija. De este proceso se encarga una enzima: metilasa de mantenimiento. El resultado puede ser la transmisión de un patrón idéntico de unión a proteínas y por tanto de actividad e inactividad génica. Cuando las cadenas se separan para la replicación, cada una retiene los grupos metilo. La metilasa coloca nuevos grupos en el sitio opuesto de la cadena recién sintetizada.
La eliminación de un grupo metilo por una enzima en un gen recién replicado hará que este gen se herede en forma no metilada. También la unión de una proteína puede impedir la metilación y es posible además que otra enzima específica añada un metilo a la cadena de un gen sin metilar, que se transmitiría de esa forma.
Se ha sugerido que este importante mecanismo de regulación génica puede tener trascendencia en los mecanismos epigenéticos del desarrollo de los organismos superiores. También se ha sugerido que los fallos de la metilación intervienen en el envejecimiento celular y en la trasformación de células normales en cancerosas)
4. ACIDO RIBONUCLEICO. (ARN).
Los ácidos nucleicos son polímeros de ribonucleótidos y aparecen en todos los organismos, desde los virus hasta las células eucarióticas.
Están formados por D-ribosa, ácido fosfórico y bases nitrogenadas, que básicamente son: adenina, guanina, citosina y uracilo (en lugar de timina). Además existen otras bases o nucleósidos accesorios, como son bases metiladas o hidroxiladas, la seudouridina o el dihidrouracilo.
Los ribonucleótidos se unen para originar largas cadenas que van desde varias decenas a millares de unidades, mediante un enlace fosfodiéster 3`,5′.
4.1.Propiedades físico-químicas del ARN
– Peso molecular. Es muy variado entre 25000 y varios millones.
– Solubilidad. Son poco solubles en agua, pero muy solubles en soluciones salinas diluidas e insolubles en disolventes orgánicos
– Absorción. Debido a la presencia de dobles enlaces conjugados en las bases, la absorción se produce en el ultravioleta, con una tasa media de 260 milimicras. Esta absorción elevada aumenta tras la degradación parcial bajo tratamiento químico (hidrólisis alcalina), físico (calentamiento), o enzimático (acción de ribonucleasa), lo que lleva al denominado efecto hipercrómico.
4.2. Estructura molecular del ARN.
Se caracteriza por la existencia de estructuras secundarias o apareamientos y terciarias u organizaciones tridimensionales
– Apareamientos internucleotídicos. Se producen entre las diferentes bases púricas y pirimidínicas que participan en la estructura primaria del ARN guanina-citosina y adenina-uracilo. Al contrario que en ADN, estos apareamientos no conducen a ningún carácter de regularidad geométrica.
– Configuración pseudohelicoidal. pueden adoptar, una configuración espacial pseudo-helicoidal, sin que presenten la regularidad del ADN. No obstante, en algunos casos (determinados virus) se pueden encontrar estructuras helicoidales bastante regulares.
4.3. Tipos DE ARNs.
Existen tres clases principales de ARN tanto en células procariotas como en eucariotas. Son los siguientes:
– ARN ribosómico (ARNr).
Dan lugar a los ribosomas o gránulos de Palade. pequeñas partículas de ribonucleoproteina, agrupadas en unidades funcionales o polisomas por fijación sobre una molécula de otro tipo de ARN, el mensajero.
En las células procarióticas dos tipos de subunidades, diferenciadas por su constante de sedimentación: 50S y 30S. En cada una de ellas se encuentra un ARN asociado a proteínas. En E.Coli tenemos que la subunidad 30S tiene un ARN de 16S y 20 proteínas, mientras que en la subunidad 50S contiene un ARN de 23S y otro de 5S, junto con 30 proteínas. En las células eucarióticas, las subunidades son de 60S y 40S.
El grado de polimerización de los ARN ribosómicos depende de las condiciones de actividad celular. Los ARN-r son ricos en guanina y citosina y tienen pocos nucleótidos con base metilada o pseudouridina. Forman numerosos bucles de apareamiento, estando muy empaquetados.
– ARN de transferencia (ARNt).
Otra denominación para los ARN de transferencia es la de ARN soluble y de constante de sedimentación 4S. Su misión es la de transferir los aminoácidos durante la síntesis de proteínas. La cadena tiene de 76 a 85 nucleótidos y se conoce la secuencia completa de alguno de ellos.
La mayoría de ellos tienen en un extremo de su cadena ácido guanílico y en el otro extremo un triplete característico: C-C-A y poseen una importante cantidad de pseudouridina, de bases metiladas y dihidrouracilo.
La configuración más probable es la de hoja de trébol propuesta en 1965 por Holley. Dos de las «hojas» se repliegan encima del plano y dos lo hacen por debajo, obteniéndose una estructura compacta, del orden de 40 x 80 A.
En uno de los bucles se encuentra la secuencia específica del aminoácido que transporta y que le identifica, es el anticodón que será complementaria del codón o secuencia presente en el ARN mensajero. Esas dos secuencias están formadas por un triplete de nucleótidos.
Posee otro dos bucles, el bucle de dihidrouracilo (reconocido por las aminoacil RNAt sintetasas) y el bucle TΨC (reconoce el ribosoma)
– ARN mensajero (ARNm).
La existencia de los ARN-m había sido predicha por Jacob y Monod en 1961, basándose en consideraciones teóricas. Se trata de un polímero de peso molecular elevado y con gran actividad metabólica, cuya secuencia nucleotídica es complementaria de la del ADN, ya que su misión es la de transportar el mensaje genético hacia donde se sintetizarán las proteínas.
– Otros ARN
Además de los tres ARN mencionados anteriormente, existen otros menos conocidos como pueden ser:
ARN nucleolar, que es el sintetizado por el nucléolo, precursor de los ARNr, el ARN-U, son unos diez tipos diferentes de pequeñas moléculas de ARN de entre 100 y 300 nt, que contienen un elevado porcentaje de uridina. Estas moléculas se unen a proteínas del nucleo para formar ribonucleoproteínas pequeñas nucleares, que realizan la maduración del ARN, eliminando intrones.
4.4. Funciones biológicas del ARN
– Retrotranscripción.
Capacidad por la cual determinados virus denominados retrovirus e incluso los recientemente encontrados en células de levadura, insectos y mamíferos, son capaces de fabricar ADN partiendo de ARN por medio de la enzima retrotranscriptasa. Lo primero que hace un retrovirus al infectar una célula es sintetizar ADN, partiendo de su ARN. Este ADN vírico se inserta en el ADN celular y dirige la síntesis de nuevos virus. El potencial patogénico de estos virus es enorme, se encuentran desde los que provocan leucemia a ratones y pollos hasta el virus del SIDA.
Para comenzar la síntesis, necesita pequeños fragmentos de ARN que actúan como cebadores, que los obtiene cortando moléculas de ARN vírico de mayor tamaño. Determinados estudios han descubierto que estos fragmentos de ARN tienen semejanza con los trasposones capaces de moverse dentro del genoma cambiando de. Existen además otros elementos genéticos como los retrotransposones o los provirus endógenos (que no pueden producir partículas víricas infecciosas) que utilizan también la retro-transcripción.
Este mecanismo ha sugerido que el ARN fue la primera molécula con significado genético y que el ADN se desarrolló con posterioridad. La versatilidad del ARN apoya dicha hipótesis: almacena información y puede replicarse, pero a diferencia del ADN puede coordinar la síntesis de proteínas e incluso puede comportarse como una enzima. Si en algún momento de la historia de la vida, el ARN cedió el papel al ADN, como conservador de la información, debió existir un mecanismo de transferencia, lo que se pudo conseguir con la ayuda de la retrotranscripción.
– Función enzimática del ARN.
Es muy importante la división del trabajo entre moléculas catalíticas y moléculas que llevan la información, pero no necesariamente tienen que ir separadas, encontrándose organismos como Tetrahymena termophila que podían unir las dos acciones denominándose ribozima.
5. REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN
5.1.La replicación
Los mismos Watson y Crick propusieron que la molécula de ADN representaba realmente un par de moldes complementarios uno del otro y la replicación consistía en la separación de las dos cadenas, actuando cada una de molde para la síntesis de otra cadena nueva complementaria. Puesto que cada nueva molécula lleva una cadena vieja y una nueva, a este tipo de duplicación se denomina replicación semiconservativa.
Frente a esta hipótesis, pueden considerarse otros modelos, como son la replicación conservativa, en la que la doble hélice original permanece intacta dando lugar a una doble hélice nueva y la replicación dispersiva en la que la molécula vieja es rota y destruida, constituyéndose las nuevas moléculas con precursores nuevos y viejos.
El apoyo experimental a la hipótesis semiconservativa vino de la mano de Meselson y Stahl. Diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E.coli con nitrógeno pesado N15 haciendo crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N15. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias se hacía sintetizado con bases nitrogenadas con N15. Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N15. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl.
El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N14. Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: las bacterias que habían estado creciendo en N15 las pasaron a medio de cultivo que contenía N14 y a distintos tiempos tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl. Cuando extraían el ADN de las bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia N14-15 entre la del ADN N14 y el ADN N15. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N14 y centrifugaban obtenían dos bandas, una correspondiente a N14 de densidad intermedia entre la del ADN N14 y la del ADN N15. La absorbancia a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN 1:1. Al extraer u centrifugar el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N14 era tres veces mayor que la encontrada en la banda de densidad intermedia proporción 3:1.
Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N14, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélice, y manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron. Si la replicación de E.coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N15 y la otra hélice N14 y al centrifugar esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida en N15 y otra menos densa sintetizada con N14. El resultado obtenido fue precisamente el esperado.
La demostración de que en eucariotas la replicación también era semiconservativa vino de la mano del experimento de Taylor, para ello utilizó meristemo radicular de Vicia faba y marcó el ADN con timidina tritiada. Cuando la reproducción cromatídica realizada durante el periodo S de la interfase tiene lugar empleando el marcaje isotópico, en la metafase de los cromosomas aparecen con sus dos cromátidas marcadas. Sin embargo, en la siguiente división celular los cromosomas aparecían con una cromátida marcada y otra sin marcar.
5.2.Síntesis in vitro de ADN
En 1956, Komberg aisló por primera vez una enzima capaz de polimerizar ADN. Se denominó ADN polimerasa I. para que esta enzima actuase se necesitaba añadir al medio ADN, iones Mg y una mezcla de los desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). El ADN añadido debía tener además unas características especiales ya que si éste era duplexo la enzima no polimerizaba y en el caso de que fuera simplexo la enzima actuaba siempre y cuando el ADN fuera capaz de formar apareamientos dentro de la cadena. Todo esto se explica ya que la ADN polimerasa necesita un extremo 3’-OH libre del ADN molde y el fosfato α del nucleótido. El pirofosfato que se hidroliza del nucleótido aporta la energía necesaria para la formación del enlace.
La ADN pol I además de realizar la polimerización en dirección 5’-3’, realiza una lectura posterior en dirección 3’-5’ y tiene actividad exonucleasa en ambas direcciones. Esta actividad exonucleasa está relacionada con la fidelidad de la copia. Puesto que la actividad polimerasa comete errores con frecuencia 10-5, la exonucleasa detecta los nucleótidos erróneos ya que producen distorsiones y los saca de la cadena que está sintetizando. Esto permite reducir la tasa de error 5×10-7. Por otra parte la actividad exonucleásica 5’-3’ va eliminando los nucleótidos que hay por delante y después polimeriza.
Posteriormente se han aislado en E.coli dos enzimas: ADN polII y ADN polIII. La primera de ellas es una enzima de reparación y con capacidad de polimerización en 5’-3’. La ADN polIII es la enzima que realmente está actuando in vivo. En realidad son un conjunto enzimático que forman la holoenzima ADN polIII. Está formado por un núcleo central con tres subunidades que a su vez se unen formando dímeros. Esta holoenzima tiene capacidad de corrección que permite disminuir la tasa de erros de 7×10-6 a 5×10-9.
En la replicación también intervienen otras enzimas. La helicasa produce la desnaturalización del ADN duplexo, unas proteínas denominadas SSB se unen al ADN simplexo e impiden la renaturalización y las ADN ligasas unen los fragmentos generados.
Por otra parte en eucariotas existen otras ADN pol diferentes: la alfa, la delta son las encargadas de replicar las dos cadenas; épsilon y beta se encargan de la reparación y gamma replica el ADN de las mitocondrias.
5.3.Replicación in vivo del ADN
Para explicar cómo puede suceder la replicación del ADN bacteriano in vivo, Gilbert y Dressler propusieron el modelo del círculo rodador, en el que una enzima hidrolítica reconoce sobre el cromosoma bacteriano un lugar específico de iniciación, produciendo una rotura en una de las cadenas. El extremo 5′ se une a la membrana celular, mientras que el 3′ es susceptible a la acción de la ADN polimerasa que va añadiendo nucleótidos al extremo 3′. Simultáneamente sobre la hélice sencilla se van sintetizando segmentos cortos que son unidos covalentemente por ligasas. La siguiente etapa consiste en la escisión de la nueva doble hélice estirada y la transferencia del nuevo extremo 5′ a otra sede de la membrana celular y así sucesivamente. Durante el proceso, la cadena intacta gira en dirección opuesta a la membrana como consecuencia del crecimiento del extremo 3′ de la otra cadena.
La ADN polimerasa no es capaz, por sí misma de replicar un ADN de doble cadena siendo solamente capaz de formar los enlaces del ADN en la dirección 5′-3′, pero no en la 3′-5′. Debido al antiparalelismo de las dos hélices del ADN y a que las ADN polimerasas solamente saben sintetizar ADN en la dirección 5’P-3’OH, la síntesis de una de las hebras se puede realizar de forma continua, pero para poder sintetizar la otra hebra al mismo tiempo se necesita polimerizarla a base de ir añadiendo pequeños fragmentos denominados fragmentos de Okazaki. Como una hélice se sintetiza de forma continua y la otra se hace de manera discontinua, se dice que la replicación es semidiscontinua.
5.4.Transcripción
Durante la interfase celular y al comienzo de la división mitótica, la información genética contenida en las secuencias de DNA cromosómico es transferida a secuencias de RNA de cadenas únicas: es la transcripción. Los RNA así sintetizados son exportados al citoplasma, donde unos (RNAm) programan la traducción de la información en cadenas polipeptídicas y otros (RNAt y RNAr) se integran en las estructuras macromoleculares de la maquinaria asegurando la traducción.
La transferencia de información entre los polímeros DNA y RNA se realiza monómero a monómero. Se basa en un ensamblaje secuencial, catalizado por las polimerasas del RNA, de precursores activados. Estos precursores activados son los cuatro ribonucleótidos trifosfato, que son ensamblados según un orden dictado por la secuencia de una de las dos cadenas de DNA. La polimerización se produce únicamente en el sentido 5`-3″.
Según las unidades de transcripción, se transcribe una a otra cadena de dúplex; como las dos cadenas de DNA son antiparalelas y la transcripción es unidireccional, cuando dos unidades adyacentes no son copiadas de la misma hebra, las polimerasas que las transcriben progresan en dirección opuesta. La utilización de una de las cadenas como matriz supone una modificación de la conformación de la doble hélice y una abertura del dúplex. En los eucariontes, la transcripción es peor conocida que en los procariontes, pero se desarrolla según un proceso bastante comparable en el que también intervienen diversas señales. La polimerización efectiva del RNA sólo se produce a partir del lugar de iniciación.
Al comienzo de la mayor parte de los genes, en los eucariontes, cuya estructura primaria es conocida, existe una secuencia de siete pares de nucleótidos ricos en adenina y timina, que es la señal que permite la unión de la ARN pol.
En las células eucariotas existen tres clases de ARN pol. La ARN pol I transcribe los ARN r de gran tamaño (18 S, 28 S, 5,8 S), la ARN pol II transcribe los ARNm y la III transcribe los ARNt y otros ARN pequeños como ARNr y ARNU.
En el caso de las células procariotas, solo existen un tipo de ARN pol para todos los tipos de ARN. Otra diferencia entre la transcripción en eucariotas y procariotas, es que la ARN pol en eucariotas necesita la colaboración de varios facotres de transcripción que permiten la unión de esta enzima al promotor para iniciar el proceso.
La cadena de RNA comienza por un ribonucleótido trifosfato purifico (ATP o GTP) y se alarga a medida que la polimerasa progresa a lo largo del DNA añadiendo nuevos monómeros al nucleótido inicial, este es el proceso de elongación. Cuando la RNA-polimerasa reconoce la última señal, que se denomina lugar de terminación, la síntesis acaba y hay disociación del complejo DNA-RNA-polimerasa que libera la polimerasa y la cadena de RNA que acaba de ser transcrita. El segmento de DNA que interviene en la síntesis de una molécula de RNA constituye una unidad de transcripción.
La unidad de transcripción contiene además señales del metabolismo postranscripcional de los RNA y señales de traducción que son reconocidas a nivel de los ribosomas: codón de iniciación y codón de terminación.
5.5.Regulación de la transcripción
Los transcritos de ARN por la ARN pol II sufren una serie de modificaciones que permiten su posterior procesamiento. Todos estos transcritos sufren una adición de la caperuza en el extremo 5’, en concreto, un nucleótido de guanosina metilado invertido. También se le añade a estos transcritos en su extremo 3’ la cola de poli A.
Estas modificaciones en los mensajeros permiten su maduración que les hace perder los intrones, o secuencias que no llevan la información para la síntesis de proteínas. Esta maduración se realiza gracias a los RNPsn que mediante el ARN que contienen, reconocen las secuencias de inicio y terminación de cada intrón y permiten su eliminación. La eliminación de intrones se realiza en muchos casos antes de terminar la transcripción en eucariotas.
En los procariotas el mensajero transcrito no sufre maduración, y el mensaje que lleva es literal del que encontramos en el ADN
A diferencia de eucariotas, es frecuente que varios genes adyacentes se transcriban juntos en forma de un solo mensajero que lleva la información para la síntesis de varias proteínas. No todas las enzimas son necesarias en todo momento. De hecho, podemos diferencia enzimas constitutivas, que se hallan en las células en cantidades constantes, y enzimas inducidas, que se elaboran cuando se necesitan. Algunas enzimas son reprimidas cuando sus productos ya no son necesarios para la célula. Esto nos demuestra que la expresión génica está regulada, de forma que no todos los genes se expresan en el mismo momento y con la misma intensidad.
Las relaciones moleculares y genéticas entre la inducción y la represión enzimáticas quedaron clarificadas por los estudios realizados por Jacob y Monod sobre el control genético de la síntesis proteica en los procariotas.
Generalmente todas las enzimas de una ruta metabólica están reguladas juntas por inducción y represión. Los genes que codifican las proteínas requeridas por la célula, para funciones estructurales o enzimáticas, se denominan genes estructurales. Estos genes bacterianos se organizan en agrupaciones que pueden ser coordinadamente controladas, formando un operón. Dentro de un operón además de los genes estructurales, podemos encontrar el gen regulador, que codifica la síntesis de una proteína represora, que al unirse a una determinada región impide la transcripción del ADN.
Podemos distinguir entre genes estructurales y genes reguladores por los efectos de las mutaciones. Una mutación en un gen estructural priva a la célula de la proteína particular que el codifica- pero una mutación en un gen regulador influye en la expresión de todos los genes estructurales que controla.
– El promotor, que es una región donde se une la ARN pol para iniciar la transcripción
– El operador, que es el lugar en el ADN al cual se une la molécula del represor impidiendo el avance de la polimerasa
Dentro de los mecanismos de regulación de operones se pueden distinguir:
– Según la naturaleza de la proteína reguladora: control negativo, si el represor al unirse el ADN inhibe la expresión de los genes estructurales, o control positivo si la existencia de cierta molécula hace aumentar la transcripción al impedir la unión al represor.
– Según la naturaleza del efector: control inducible, si el represor es activo y se inactiva al unírsele el efecto o control reprimible si el represor necesita al efector para activarse y unirse al ADN
Dos ejemplos de la regulación de operones son el operón de la lactosa y el operón de la histidina. El primero es un ejemplo de control inducible, ya que la síntesis de las enzimas encargadas de la metabolización de la lactosa es inducida por la propia lactosa. En una célula no inducida, la proteína represora codificada por el gen regulador se une al operador e impide la transcripción de los genes estructurales. Pero en presencia de lactosa, esta se une al represor, provocando un cambio conformacional en el mismo que provoca su disociación del ADN, la ARN pol actúa, fabricándose las enzimas encargadas de metabolizar la lactosa.
Cuando desciendan los niveles de lactosa, la proteína represora volverá a ser activa, se bloqueará el operador y las enzimas dejarán de sintetizarse.
El operón de la histidina es un ejemplo de control reprimible. La síntesis de las enzimas encargadas de fabricar la histidina es reprimida por la presencia del propio aminoácido. La histidina se sintetiza normalmente, pero al aumentar su concentración, esta se une al represor, lo activa, permitiendo que se una el operador y reprima la expresión de los genes estructurales. Cuando disminuye la concentración del aminoácido se vuelve a inactivar el represor y se pone en marcha de nuevo la síntesis de histidina.
Existen otro modelos de regulación de la transcripción en procariotas como la atenuación mediante una secuencia líder, la unión al promotor de ciertas proteínas como la activada por catabolito o la receptora de AMPc, la tª, la presencia de ARN antisentido o la reorganización del ADN
La regulación de la transcripción en eucariotas es un proceso más complejo:
– La secuencia reguladora no se halla siempre cerca del promotor, pudiendo estar tanto a 5’ de éste como a 3’ de la terminación, lo cual conlleva a la formación de bucles que permita la interacción entre las proteínas reguladoras y la ARN pol
– Las proteínas reguladoras suelen formar familias donde una única proteína puede controlar la expresión de varios genes, o bien, diferentes combinaciones de un mismo grupo de proteínas reguladoras actúan sobre genes diferentes
– El empaquetamiento del ADN también afecta a la transcripción, al igual que la metilación de las citosinas del ADN impide la transcripción de ciertos genes
– Otros mecanismos de control de la transcripción son los post-transcripcionales o los de amplificación genética, que permiten regular la actividad celular.
6. BIBLIOGRAFÍA
– Alberts y col. Biología molecular de la célula. Omega, Barcelona 2004
– LACADENA, J.R.: Genética. Ed.Agesa. Madrid, 1973.
– Griffiths. Gamética. Mc graw-Hill interamericana España. Madrid 2002