1) Introducción.
2) Métodos de estudios celulares:
2.1.- Métodos de separación de células.
2.2.- Cultivos celulares.
2.3.- Fraccionamiento celular.
2.4.- Técnicas de microscopia.
3) Células procariotas y eucariotas.
4) La célula animal y vegetal.
5) Formas acelulares:
5.1.- Virus.
5.2.- Viroides y priones.
Introducción: los primeros estudios con el microscopio óptico rudimentario fue por la época de mediados del siglo XX. Hooke fue el primero en observar unas celdillas a las que llamó “célula”.
En 1838-39 se propone que todos los organismos tanto animales como vegetales están formados por células y la denominan como la unidad fundamental. Luego se amplía la teoría celular, diciendo que cada célula procede de otra, y además se dice que todas tienen un antepasado en común. Hasta 1900 se pensó que la célula era una estructura rodeada por una envuelta, en cuyo interior había enzimas. En 1932 surge el microscopio electrónico y no es hasta 1952 cuando se empieza a utilizar el microscopio electrónico para el material biológico. Con la ultra centrifugación en 1974, se pudo aislar los orgánulos de una célula y se vieron imágenes por el microscopio electrónico de la célula (Claude, Palade y de Duve).
En 1960 se pudo cultivar células en un laboratorio. Así surgen las cromatografías y electroforesis para poder purificar las células.
Los términos de última generación son: donación (obtener un embrión a partir de una célula adulta donadora de un núcleo que va a ser implantado en un útero, en el cual se va a desarrollar; las células serán repetitivamente iguales), células madre (un cigoto, en su primera división da lugar a dos células; una de ellas mantiene la unión con su madre, y la otra da lugar a un nuevo individuo) y apoptosis (muerte celular programada; las células cancerígenas no sufren apoptosis).
Métodos de estudios celulares: se comienza con la obtención de suspensiones. Para estudiar las células por separado se necesita una suspensión, como es el caso de la sangre → tejido en suspensión. Se hace la suspensión (número determinado de células inmersas en un fluido; mezclas constituidas por un sólido en polvo o en pequeñas partículas y un líquido en el que no es soluble) para obtener la molécula. Para ello se debe de llevar a cabo un método de disgregación, de lo cual hay tres tipos, basados en el conocimiento en esas matrices:
1.- Mecánico: métodos de rotura, aplastamiento, troceado con pinzas, agujas,
2.- Químico: secuestrar iones divalentes con quelantes, como por ejemplo EDTA (ácido etilendiamino-tetra-acético), detergentes (forman micelas, que actúan con los fosfolípidos y la membrana se rompe).
3.- Digestivos o enzimáticos: usando enzimas proteolíticas como la tripsina
Después de la disgregación se debe de tener en cuenta algunas consideraciones:
– Que presenten heterogeneidad y representatividad de la muestra
– Rendimiento de la disgregación
– Estado de las células / orgánulos (examen citológico)
– Proporción de eventos anómalos (aneuploidías)
Normalmente se utilizan una mezcla de los tres tratamientos.
Partimos de una fuente de células, que puede ser tejido sólido o suspensión. El mejor material procede de embriones o postnatal, y sobre éste se realizan los tratamientos:
Tratamiento mecánico Tratamiento químico Tratamiento enzimatico
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Agitación suave
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Filtración (Población heterogénea) CMF (Población homogénea
Métodos de separación de células:
-Filtración: es uno de los métodos más sencillo para la separación de células; depende del filtro, tamaño de la partícula, viscosidad del medio y de la colmatación. Se utilizan filtros de diferente naturaleza y distinto diámetro de poro; es un método no selectivo.
-Elutración: sistema de filtrado a flujo continuo. Filtra a contracorriente (centrifugación a contracorriente). Lindgerg (1932); consiste en una centrifugación por lavados; se basa en la Ley de Stokes, en la cual la velocidad de sedimentación depende del radio de la partícula, la densidad de la partícula, la densidad del medio y de la fuerza centrífuga. Si la densidad del medio y la densidad de la partícula son iguales, la velocidad de sedimentación es nula. A mayor viscosidad, menor velocidad de sedimentación. A mayor centrifugación, mayor velocidad de sedimentación.
– Sistemas Acuosos Bifásicos: es un método de separar preparados en agua, donde se tienen dos fases. Se utiliza para separar células aunque se suele utilizar para separar proteínas de la membrana. Se basa en utilizar dos polímeros incompatibles entre ellos y prepararlos en una solución acuosa. Los polímeros más utilizados son el polietilenglicol (PEG) y el dextrano. Con la mezcla de ambas disoluciones se formaran pequeñas gotas que migraran en función de la densidad, las células se unirán a las gotas en función de las cargas celulares.
– Métodos inmunológicos:
+ Soportes magnéticos
+ Cromatografía de afinidad
Soportes magnéticos: utilización de bolitas, que son núcleos de hierro de poliestireno recubiertas por una matriz; de un tamaño menor de 50 micras. Para separar poblaciones celulares: los soportes magnéticos se unen covalentemente con los anticuerpos específicos de un antígeno celular deseado, se colocan en un tubo con toda la población celular y con un imán capturamos la población deseada.
Cromatografía: hay muchos soportes para realizar una cromatografía. Surgió para separar moléculas de bajo peso molecular, pero se ha extendido su uso.
+ De columna: columna con una matriz, de unas características peculiares, en la parte interna a la que se añade un eluyente, que es un solvente determinado y se añade a la suspensión de células, proteínas o extracto de plantas; según las características de la matriz irá separando la suspensión en diferentes franjas; se sigue añadiendo solvente; las franjas bajan y se van recogiendo por el inferior. Hay más tipos de cromatografía, como:
+ De intercambio iónico: columna con una matriz con carga determinada.
+ De filtración de gel
+ Afinidad: matriz a la que se une covalentemente un anticuerpo que va a ser específico para las células que queremos separar.
-Sedimentación: se utiliza para aislar y purificar células por medio de la centrifugación. Células agrupadas según presenten o no pared. Las células sin pared son las más difíciles de tratar.
Centrifugación: toda partícula en suspensión está sujeta a las fuerzas de la gravedad; además, si lo centrifugamos, se sumará la F centrífuga, que es mayor a la gravedad. Las fuerzas centrífugas son dependientes de la velocidad angular y de la distancia al eje de rotación.
Características de los medios:
– Isotónico: equilibrio en el movimiento de las masas de agua; entra tanta agua como la que sale.
– Hipotónico: movimiento neto del agua hacia el interior celular; entra más agua de la que sale.
– Hipertónico: movimiento neto del agua hacia el exterior celular; sale más agua de la que entra.
Centrifugación diferencial: Es el método más común de separación, y es rara la purificación enzimática que no lo utiliza. En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. El método es bastante inespecífico, y a priori no se puede saber si la partícula buscada quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos; sin embargo es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares.
Centrifugación en gradiente de densidad:
Este método es algo más complicado que la centrifugación diferencial, sin embargo presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica no solo permite la separación de varios, si no todos, los componentes de la muestra, sino que también permite realizar medidas analíticas.
El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:
– Centrifugación zonal: La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. Medida por el coeficiente de sedimentación:
– Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica: La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado.
– Citometría de flujo (CMF): comenzó en los años 60, pero no es hasta los años 70 cuando empieza a tener utilidad en medicina y biología. Usado para clasificar, contar y medir células; utilizada en muchos laboratorios clínicos y de investigación. Utilización de un haz de luz de alta intensidad sobre una muestra, ya sea heterogénea u homogénea. Capaz de medir varios parámetros de cada una de las células y medición de fluorescencia y dispersión de la luz.
La muestra, siempre en suspensión, pasará a través de una cámara de flujo, donde un haz de luz incide y determina una serie de características, como es:
+ Dispersión: frontal (es proporcional al tamaño de la célula) y lateral (es proporcional a la complejidad interna de la célula)
+ Fluorescencia (proporcional a parámetros funcionales de la célula) muestras teñidas con fluorocromo y con el haz de luz distinguimos tres emisiones de fluorescencia si hemos utilizado tres fluorocromos diferentes (F1, F2 y F3). Si hubiera dos haces de luz se podría detectar hasta 4 emisiones diferentes.
El aparato recibe el nombre de citómetro de flujo, que mide componentes y propiedades de las células en la suspensión. Cuando, además puede separarlos en diferentes poblaciones, recibe el nombre de FAC-SCAN.
Electroforesis:
La electroforesis es una técnica que separa proteínas o compuestos porque se mueven con diferente velocidad al ser sometidos a un campo eléctrico.La velocidad depende del tamaño de la partícula y de su carga: Movilidad electroforética de la partícula es la relación entre el tamaño y la carga, cuando el campo eléctrico es la unidad.
CULTIVOS CELULARES
Los cultivos celulares empezaron siendo como una mezcla entre arte y ciencia, a principios del siglo XIX. Por esa época habían muchos problemas a la hora de cultivar células in Vitro, esto tuvo que vencer muchos obstáculos, pero a medida que fueron apareciendo medicamentos, equipos de cultivo, … se fueron subsanando.
Actualmente muchas compañías suministran medios de cultivos, medios definidos, los equipos, las líneas celulares, … permitiendo que las técnicas de cultivo sean reproducibles.
Cultivo celular: todas las técnicas que permiten crecer y mantener las células in Vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Hay dos grupos de cultivos:
+ Cultivos de órganos: son fragmentos de tejidos u órganos mantenidos in Vitro y que funcionan igual que como funcionarían in vivo
+ Cultivo de células: propagación de células dispersas y que pueden crecer en suspensión o en monocapas. Las monocapas pueden crecer en medios plásticos o en vidrio.
¿Qué podemos cultivar? Distintos tipos de células (tipos celulares) como pueden ser fibroblastos y otras células con menos posibilidad de crecimiento.
¿Donde y cómo podemos llevar a cabo estas técnicas de cultivo? Necesitamos laboratorios y equipamiento específico. Las técnicas de manipulación son muy exigentes (son costosas y se necesita personal cualificado).
Algunos de los problemas que surgen es que las células normales no sobreviven mucho tiempo en el cultivo, ya que al cabo de un número determinado de divisiones mueren, y sufren también inhibición por contacto. Por lo que hay que hacer replaqueos, cuando el espacio de la placa de cultivo se esté agotando ya que éstas crecen en monocapa. Por todo esto se utilizan líneas celulares que son variantes de las células normales, son células transformadas que se dividen indefinidamente, pueden crecer en suspensión (las normales no) y no sufren inhibición por contacto. Un ejemplo de una línea celular:
Células Hela: es una línea celular que proviene de un cáncer de cerviz uterino de una mujer que murió; y hoy en día se siguen reproduciendo y los laboratorios los comercializan (1951). Son células transformadas (inmortales).
Los cultivos celulares sirven para transformaciones celulares, estudios con genes, pruebas de toxicidad y para producir capas virales. Es una herramienta que cada vez se utiliza más.
Las células vegetales también se pueden obtener en cultivos celulares y los medios de cultivo en vez de utilizar los factores de crecimiento peptídicos (que utilizamos con las células animales) vamos a utilizar otras sustancias como son: ácido abcísico, auxinas, giberelinas, citocinas y etileno (estas sustancias atraviesan las paredes celulares. Se obtiene un callo, el cual comienza a dividirse y da lugar a un tejido, un órgano e incluso una planta completa.
Las células vegetales son totipotentes (tienen la capacidad de diferenciarse). Una célula puede diferenciarse en cualquier tipo celular (una célula del parénquima por ejemplo pueda diferenciarse y dar una célula del clorénquima).
Las auxinas, giberelinas y citoquininas son sustancias que estimulan el crecimiento.
El ácido abcísico y etileno son sustancias que suelen inhibir el crecimiento.
FRACCIONAMIENTO CELULAR:
El fraccionamiento celular es una técnica con gran utilidad. Nos permite aislar orgánulos para el estudio de sus componentes, formas resistentes, para la purificación y aislamiento de las proteínas. A partir de una suspensión de células o tejidos, utilizando un shock osmótico, congelación-descongelación, ultrasonidos, detergentes o bien un émbolo de Potter o de aspas se obtiene un homogeneizado.
El objetivo de la homogeneización es conseguir el máximo grado de rotura de la célula sin dañar las estructuras subcelulares.
Para ello hay que tener unos factores en cuenta:
-Tiempo (lo menos posible)
-Mantenimiento de la integridad funcional (utilizando unas temperaturas apropiadas para que no se estropee la muestra).
-Redistribución de macromoléculas
-Tipo de célula y de tejido (tipo de material que estemos utilizando). Si estamos con células eucariotas tendremos orgánulos con membranas y si estamos trabajando con células procariotas no habrá orgánulos con membranas. Las membranas una vez se rompen pueden volver a unirse y formar una nueva membrana.
¿Cómo se puede hacer una homogenización? -~ uno de los métodos para producir rotura de la membrana es mediante un shock osmótico, para lo cual trabajamos con un medio hipotónico, las moléculas incorporan agua al interior y puede llegar un momento que se rompen las membranas. El shock osmótico nos interesa para obtener cromosomas o mitocondrias (aunque estos tienen membrana, ésta es doble, así que resisten un poco más), pero no nos sirve para otros orgánulos porque se pueden romper las membranas.
Purificación del homogeneizado:
Una vez obtenido el homogeneizado, vamos a separar en fracciones en función de la densidad:
– centrifugación diferencial
– centrifugación en gradientes de densidad:
+ zonal
+ isopícnica
¿Cómo podemos identificar el material fraccionado?
– control al microscopio electrónico
– marcadores enzimáticos
– marcadores no enzimáticos. Utilizamos anticuerpos para ponerlo de manifiesto
TÉCNICAS DE MICROCOPÍA
Con el microscopio se observan estructuras que el ojo humano no puede visualizar.
Un microscopio simple (de una lente o varias lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles que los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.
El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.
Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
+Microscopio de campo claro ó compuesto: Es descendiente de los disponibles a partir de 1800. Son los microscopios más usados, pudiendo ser binoculares o trioculares (el tercer puesto es para la adaptación de una cámara de fotos).
Consta de un sistema mecánico y un sistema óptico:
El sistema mecánico posee una base que estabiliza el microscopio, un vástago, donde está la platina, sistema de enfoque, revolver que soporta las lentes y los objetivos.
Y el sistema óptico: fuente luminosa que ilumina la muestra, condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra, la platina sobre la cual se coloca la muestra, el objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra y el ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este no produce un nivel útil de contraste.
La platina es la plataforma donde se pone la muestra. Tiene un agujero por donde pasa la luz. Mecanismo de enfoque es el macrométrico y el micrométrico para enfocar.
El revolver es un sistema que soporta los objetivos. Están parfocalizados, es decir, cuando se pone el objetivo más pequeño, y luego se pasa a otros de aumento gradualmente superior, para que quede enfocada la muestra sólo hay que girar ligeramente el micrométrico.
Lo que se va a ver es el espectro visible, el espectro visible va desde los 380-730 nm (límite ultravioleta — límite infrarrojo).
Poder de resolución: es la calidad de la imagen; es la capacidad de diferenciar dos objetos próximos como entidades separadas; matemáticamente es PR =1/LR. El poder de resolución del microscopio óptico es de 0,2 micras, lo que nos permite ver células y muchos orgánulos celulares.
Límite de resolución: es la distancia mínima a la cual dos objetos próximos se diferencian como entidades separadas. Viene dado por la constante de Abbe K;
+Microscopio de campo oscuro: El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. La imagen se ve brillante en un fondo oscuro, La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo claro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado.
+Microscopio invertido: está invertido; los objetivos están en la parte inferior y están enfocando hacia arriba; el condensador y la fuente de luz están en la parte superior enfocando hacia abajo. Con la ayuda de este microscopio se puede ver las muestras independientemente del frasco donde estén. La ventaja del microscopio invertido es que se pueden observar células vivas durante un tiempo.
+Microscopio de fluorescencia: Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores
+Microscopio de contraste de fase: Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La célula de por sí, presenta zonas más densas que otras, como es el caso de que el núcleo presente más densidad que el citoplasma. Debido a esta propiedad de la densidad, tendrán diferentes índices de refracción. El índice de refracción de la zona más densa será diferente al índice de refracción de la zona menos densa. Aprovechando esto, ya que el ojo humano no lo ve, se creó este microscopio. Una célula viva se comporta como un objeto fásico. La zona más densa, retrasa la fase de las ondas lumínicas 1/4 de su longitud de onda normal.
+Microscopio de polarización: Este microscopio es una simple modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo filtro, denominado analizador entre el objetivo y los oculares.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares.
+Microscopio de interferencia diferencial o Nomarski: Combina microcopio de contraste de fase y microscopio de luz polarizada. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases.
+Microcopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Utiliza un sistema de iluminación de rayo láser de árgon monocromático.
+Estereomicroscopios: Microscopio Binocular Estereoscópico. Este instrumento proporciona una visión genuinamente estereoscópica. En realidad, el dispositivo consiste en dos microscopios, cada uno con objetivo y ocular propios, unidos y soportados por la misma base.
+Microscopia electrónica: Dentro de los microscopios electrónicos tenemos el de barrido y el de transmisión. La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos está en que la longitud de onda utilizada es mucho menor, lo cual aumenta la resolución.
Se produce el mismo efecto que los fotones de luz en las lentes ópticas, pero en este caso son electrones en lentes electromagnéticas.
Límite de resolución del ojo humano: 0,2 milímetros.
LR del microcopio óptico: 200-300 nanómetros.
LR del microcopio electrónico de transmisión: 0,3 nanómetros.
LR del microscopio electrónico de barrido: 10 nanómetros.
+Microscopio electrónico de transmisión: La óptica es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible. Permite ver una ultraestructura en plano. La muestra va fijada con tetroxido de osmio o acetato de uranilo. el cátodo es un filamento de tougsteno que al calentarse emite electrones que se dirigen hacia el ánodo que es una placa metálica con un orificio. La diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo hace que se cree el haz de electrones. Se trabaja al vacío. Trabaja a un voltaje de entre 50-100 Kv, a mayor voltaje menor longitud de onda, menor límite de resolución y por tanto mayor poder de resolución. El de barrido trabaja a un voltaje de entre 10-30 Kv.
+Microscopio electrónico de barrido: Se asemeja más a una televisión que. Para analizar la mayoría de los tejidos, se deja que la muestra se deshidrate por desecación a punto. Se logra el barrido de los electrones sobre la muestra, gracias a unas bobinas que hace que el haz de electrones sea móvil y barra la muestra de punto a punto. La muestra estará recubierta por una fina capa de oro, los electrones reflejados o secundarios son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional de la morfología externa de la muestra en una televisión.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO
1.- Disección: proceso de obtener muestras. Se lleva a cabo en condiciones de anestesia. No es conveniente hacer uso de anestesia en muestras del sistema nervioso.
2.- Fijación: básicamente la célula se fija con el propósito de preservar las estructuras celulares y queden lo más parecido a como estaban en vida. Produce cierto grado de endurecimiento de las muestras, pero no lo suficiente para hacer cortes muy finos.
3.- Inclusión: proceso mediante el cual se introduce la muestra en un medio líquido que endurecerá con el tiempo, dando lugar a bloques. El medio de inclusión se infiltra por los poros de la muestra. Confiere grado de dureza tal que se puede cortar (es un medio líquido que luego solidifica). Los medios pueden ser:
-Hidrofílicos: no dan problema
-Hidrofóbicos: son los más usados; primero hay que llevar a cabo la deshidratación de la muestra.
4.-Corte: los cortes de ese bloque obtenido se preparan en un portaobjetos si se va a observar a microscopio óptico o en rejillas si es para el microscopio electrónico. El grosor del corte dependerá del objetivo del mismo y del tipo de microcopio que vamos a usar. Los cortes se llevan a cabo con un microtomo que da cortes de grosor de 40-5 micras, utiliza cuchilla de acero y se usa para microscopia óptica. El ultramicrotomo produce cortes de 600-800 amstrongs, su cuchilla es de diamante o de vidrio y se usa para microscopia electrónica.
5.-Coloración: añadimos color a las muestras usando uno o varios colorantes (MO) o hacemos un contraste con sales de metales pesados (ME).
7.-Montaje: para microscopia óptica: se coloca la muestra sobre un portaobjetos, luego sobre la muestra se dispone un medio de montaje viscoso y muy transparente y por último el cubre objetos. Se utiliza una rejilla para el electrónico.
La criofractura: es una nueva técnica de preparar las muestras para observar al microscopio electrónico. Se utiliza para observar componentes de las membranas. Se congela la muestra en nitrógeno líquido -196ºC. Se fractura con una cuchilla por la zona de máxima debilidad, que es por donde se unen las colas de los fosfolípidos así partimos la membrana en dos.hacemos u sombreado metálico con oro o paladio, recubro la muestra con carbón, elimino la muestra con un ácido o un detergente y me quedo con la réplica para su posterior observación al microscopio, aumentando así la resolución.
2. Células procariotas y eucariotas.
La célula es una formación constituida por tres elementos básicos: membrana plasmática, citoplasma y material genético (ADN). Un rasgo esencial de todas las células es su membrana plasmática (también llamada membrana celular) que separa la célula de su ambiente exterior, otro rasgo es el material genético (la información hereditaria) que dirige las actividades de la célula y le permite reproducirse para transmitir sus características a sus descendientes. Por último el resto del contenido de la célula, es decir, todo aquello que está dentro de la membrana celular, excepto el material genético es el citoplasma. La membrana plasmática está constituida por una doble capa lipídica en la que aparecen, englobados o adheridas a su superficie una serie de proteínas. El Citoplasmas incluye el medio interno líquido o citosol y una serie de estructuras que reciben el nombre de orgánulos celulares y que constituyen el llamado morfoplasma. El material genético lo constituyen uno o varios filamentos de ADN.
Veamos las principales características de ambos tipos de células:
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Células Procariotas |
Células Eucariotas |
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organismos |
Bacterias (eubacterias y arqueobacterias), las cianobacterias y los proclorófitos. |
Protoctistas, hongos, plantas y animales. |
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tamaño |
Oscila entre 1000 y 10000 nm |
Mayores. Entre 20 y 50 micras, aunque las haya de hasta varios centímetros. |
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formas |
Muy pocas. Esféricas (cocos), de bastón (bacilos), de coma (vibrios) o de sacacorchos (espirilos). Son unicelulares aunque algunos pueden formar colonias. |
Gran variedad. Hay células libres (amebas, leucocitos) que pueden cambiar de forma emitiendo pseudópodos. Las células unidas a otras forman tejidos. |
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Membrana plasmática |
Es similar a la de las eucariotas. En Bacterias presenta repliegues llamados mesosomas, que aumentan la superficie de la membrana permitiendo su duplicación, se encargan de la respiración, de la fotosíntesis en las bacterias fotosintéticas, de asimilar NO3 o NO2 en las nitrificantes y N2 atmosférico en bacterias que poseen la enzima nitrogenasa. Prácticamente carecen de esteroles. |
Es similar a la de las procariotas, pero con los esteroles como componente fundamental de la fracción lipídica. |
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Pared celular |
Se encuentra en el exterior de la membrana. Según el tipo de pared las bacterias se distinguen en Gram + donde la pared es monoestratificada y constituida por una gruesa capa de peptidoglucanos (mureina) a la que se asocian proteínas, polisacáridos y ácidos teicocicos. En las Gram – es biestratificada con una capa basal fina de mureina y una membrana externa constituida por una doble capa lipídica con un gran número de proteínas y liposacaridos. Las cianobacterias tienen una pare similar a las Gram – . En bacterias patógenos hay una cápsula recubriendo la pared y en las cianobacterias una vaina gelatinosa. |
Las células eucariotas vegetales tienen una gruesa pared de celulosa. Las células animales no tienen pared pero presentan un glucocalix inmerso en una membrana de secreción llamada matriz extracelular. |
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Citoplasma. Estructuras membranosas. |
Las únicas estructuras delimitadas por una membrana unitaria son los tilacoides de las cianobacterias |
Encontramos gran variedad de orgánulos membranosos con funciones definidas:retículo endoplásmático, aparato de golgi, vaculas, mitocondrias, cloroplastos,lisosomas,etc |
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Células procariotas |
Células eucariotas |
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Citoplasma. Estructuras no membranosas |
Encontramos ribosomas con coeficiente de sedimentación 70s. |
Ribosomas con coeficiente de sedimentación 80s, citoesquelo con sus microtúbulos. En eucariotas animales además centríolos. |
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Lugar del Material genético |
No tienen núcleo delimitado por una membrana. Su ADN se sitúa en una zona central de la célula llamada nucleoide. |
Tienen su material genético rodeado por una doble membrana constituyendo el núcleo y esta membrana presenta poros que comunican el interior del núcleo con el citoplasma. |
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ADN |
Es una sola molécula circular de doble hélice que puede estar asociada a proteínas, pero sin formar nucleosomas. Algunos procariotas presentan unos pequeños anillos de ADN independientes del cromosoma bacteriano, capaces de duplicarse y que confieren importantes propiedades al individuo, son los llamados plasmidos.Sus genes son continuos, es decir todo gen produce una proteína |
Está constituido por varios filamentos lineales y de doble hélice que se asocian a histosomas formando nucleosomas que al condensarse forman los cromosomas. Sus genes son discontinuos, es decir, con partes que se expresan en proteínas y partes que no. Presentan ADN extracelular en mitocondrias y cloroplastos. |
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ARN |
Para la síntesis de ARN, solo hay una ARN-polimerasa, por tanto, la transcripción y traducción tiene lugar de forma acoplada. |
En la síntesis de ARN, la transcripción se produce en el núcleo por medio de tres ARN-polimerasas, posteriormente en el citoplasma en los ribosomas se produce la traducción a proteínas. |
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División |
No hay mitosis. División por bipartición. |
Mitosis o meiosis. La mitosis genera células con idéntica dotación cromosomita. La meiosis permite la formación de células con la mitad de cromosomas, es decir, se generan gametos |
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Metabolismo. |
La mayoría son heterótrofas. La fotosíntesis es anoxigénica, pero en cianobacterias es oxigénica. |
Autótrofas o heterótrofas. La nutrición autótrofa en vegetales se realiza mediante la fotosíntesis. |
La célula procariota
La célula animal y Vegetal
Las células eucariotas presentan dos tipos de modelos de organización que corresponden a la célula eucariota animal y a la célula eucariota vegetal.
La célula animal típica tiene un núcleo definido y es heterótrofa, es decir, se alimenta de materia orgánica que puede ingerir en forma sólida, y tiene desarrollados los orgánulos de la sensibilidad y el movimiento.
La célula vegetal es autótrofa, es decir, capaz de fabricar su propia materia orgánica a partir de materia mineral, lo cual realiza por medio de la fotosíntesis, y no tiene desarrollados los orgánulos de la sensibilidad y el movimiento.
Arquitectura de la célula.
Todas las células son básicamente muy similares porque contiene muchas estructuras iguales, los mismos tipos de enzimas y el mismo tipo de material genético.
Membrana celular.
No es una barrera que aísle la célula del exterior sino que a su través tiene lugar el intercambio de sustancias con el exterior, necesario para la nutrición, excreción y la respiración célula. Todas las células están rodeadas por una membrana externa la membrana celular también llamada membrana plasmática. Mide 7 a 9 nanómetros de espesor y solo se puede resolver con el microscopio electrónico. La membrana de las células eucariota consiste en una doble capa de moléculas de fosfolípidos dispuestas con sus colas hidrofóbicas hacia dentro y el ceno de este medio algunas moléculas de colesterol. Incrustadas en esta estructura general se encuentras numerosas proteínas muchas de las cuales atraviesan la membrana de parte a parte. También hay proteínas en la cara interior y exterior de la membrana. Muchas de estas proteínas son enzimas que regulan el paso de sustancias, de manera que los nutrientes y productos de desecho entran y salen dependiendo de las necesidades celulares.
La pared celular.
Una distinción fundamental entre las células vegetales y animales es que las primeras están rodeadas por una pared. La pared está por fuera de la membrana. La pared celular de los vegetales tiene su origen en la misma división celular, ya que, al separarse las células hijas se forma entre ellas una fina lámina de un polisacárido llamado pectina, sustancia que es muy permeable. A esta lámina se le llama pared primaria. A partir de esta pared primaria la célula por secreción va depositando sucesivas capas de polisacáridos constituyéndose así la pared secundaria, cuyo componente principal es la celulosa. En esta capa de celulosa existen unos poros de comunicación entre células vecinas que se denominan punteaduras. La celulosa de la pared celular pode impregnarse de otra sustancia, según las funciones de la célula: la lignina endurece la célula de los tejidos de sostén; la cutina y la suberina impermeabilizan las células de los tejidos protectores.
El Citoplasma.
El citoplasma es una solución acuosa de proteínas, sales minerales y otras sustancias, en cuyo seno se encuentran los organuelos: reticulo endoplásmico, ribosomas, aparato de Golgi. Estos tres organuelos son los lugares especialmente destinados para la síntesis de sustancias que la célula necesita. Los ribosomas juegan un papel fundamental en la síntesis de proteínas. Son organuelos de estructura visible únicamente al microscopio electrónico compuestos por ARN y proteínas. Los ribosomas pueden encontrarse libre en el citoplasma o adheridos al retículo endoplásmico. El retículo endoplásmico es una red de túmulos y sáculos distribuidos por todo el citoplasma donde las proteínas se almancenan y sufren transformaciones químicas según las necesidades de la célula. El aparato de Golgi es una agrupación de sáculos de morfología peculiar que transforman los productos que se almacenan en le retículo endoplásmico formando vesículas con alguna función especial, por ejemplo para la secreción de sustancias al exterior de la célula. Suele estar más desarrollado en las células animales que en las vegetales. Las mitocondrias son pequeñas bolsas en seno del citoplasma, visibles al microscopio óptico y con una estructura peculiar. El orgánulo esta delimitado por una doble membrana de constitución similar a la membrana plasmática; la membrana interna sufre unas invaginaciones que constituyen las crestas mitocondriales, la cuales contiene enzimas necesarias para realizar la respiración celular. Los cloroplastos son organuelos de apariencia similar a las mitocondrias aunque generalmente son algo más grandes. Están también delimitados por una doble membrana pero en este caso la membrana internase prolonga las láminas que recorren el orgánulo longitudinalmente, que reciben el nombre de lamelas. La lamela tiene en su recurrido unos engrosamientos a modos de granos llamados grana, que aparecen de color verde al microscopio óptico. El espacio delimitado por la membrana del cloroplasto se denomina estroma, los cloroplastos son los organuelos donde las células vegetales realizan la fotosíntesis porque allí almacenan clorofila, gracias a la cual sintetizan su propio alimento. También hay plastos que almacenan almidón. Las vacuolas y los lisosomas. El termino vacuola puede englobar a cualquier vesícula delimitada por una membrana y cuyo contenido sea distinto al del resto del citoplasma. Su origen está en el retículo endoplásmico o en el aparato de Golgi. La vacuolas de las células animal suelen tener alguna actividad vital la vacuolas digestivas se encargan de digerir las partículas alimenticias sólidas que penetran en la célula; esta acción la desarrollan en combinación con los lisosomas. Los lisosomas son vesículas originadas en el aparato de Golgi que están llenas de enzimas digestivas; su membrana esta interiormente revestida de mucopolisacaridos que impiden que la vesícula sea digerida por su propio contenido. Estas vesículas no están presentes en la célula vegetal; ya que es autótrofa y no necesita digerir productos sólidos orgánicos. Las vacuolas de la célula vegetal suelen actuar como almacén de productos de desecho o de excreción. Su tamaño va creciendo con a vida de la célula, llegando a ocupar la mayor parte del citoplasma desplazando el núcleo a un lado de la célula. Tanto la célula animal como la vegetal pueden almacenar productos de reserva alimenticia o de excreción sin rodearlos de ninguna membrana, permaneciendo en el citoplasma sin disolverse en el, a estas formaciones se les llama inclusiones, como es el caso de las gotas de grasa de los adipositos que son células de los tejidos de reserva de los animales o de los cristales de proteínas o de oxalato de muchas células vegetales. Citofibrillas, centrosomas, orgánulos vibratiles. Las citofibrillas son proteínas fibrilares abundantes en el citoplasma, capaces de unirse entre sí y formar estructuras, tales como citoesqueletos y las fibras del huso acromático de la división celular. El centrosoma se considera el órgano rector de la sensibilidad y el movimiento de la célula. No está presente en la célula vegetal. Está formado por dos granulos llamados centriolos, perpendiculares entre sí. Los orgánulos vibratiles se llaman cilios y si son cortos y numerosos, y flagelos si son largos y escasos.
El Núcleo.
- Estructura y componentes: El núcleo aparece siempre como un corpúsculo fácilmente visible en el seno del citoplasma. Es el órgano rector de la vida de la célula, de manera que las células privadas de núcleo mueren al propio tiempo. En cuanto a sus componentes podemos distinguir la membrana nuclear, el jugo nuclear, los nucleólos y los cromosomas. La membrana nuclear es una continuación del retículo endoplasmático que envuelve el núcleo. Por eso aparece como una membrana doble, y presenta unos poros a través de los cuales pasan las sustancias del núcleo al citoplasma y viceversa. El jugo nuclear es una dispersión acuosa similar al citoplasma en cuyo seno se encuentran las demás estructuras. Los nucleolos son fácilmente observables en el núcleo. Son normalmente uno o dos y constituyen los puntos donde el ADN de los cromosomas sintetiza ARN, y están formados por una masa de moléculas de ARN en torno a un filamento de ADN. Los Cromosomas son cuerpos en forma de cinta o bastón que aparecen en el núcleo cuando la célula se prepara para la reproducción, pues mientras la célula está en reposo, los cromosomas no son visibles. La estructura del cromosoma consta de un doble filamento de ADN fuertemente arrollado y de proteínas que tienen como función mantener esa estructura estable.
La célula animal
La célula vegetal
Formas acelulares
Se trata de partículas de tamaño inferior al de la célula y con organización mucho más sencilla. No realizan funciones de nutrición, relación y sólo pueden reproducirse en el interior de la célula huésped utilizando estructuras y materiales de la misma.
Los virus son parsitos intracelulares obligados y su ciclo vital presenta dos fases:
Fase extracelular: se les denomina viriones, son totalmente inertes ya que no poseen enzimas para poder desarrollar un metabolismo propio. Son un vehiculo de transporte del ácido nucleico.
Fase intracelular: el ácido nucleico se replica dentro de la célula huésped y dirige la formación de nuevas cubiertas proteicas utilizando las enzimas y otros equipos metabólicos de la célula huésped.
Virus, su estructura: el tamaño de los virus abarca desde unos 17 nanómetros hasta unos 300 nanómetros, estos últimos están en los límites de resolución de un microscopio óptico. Los virus consisten en un ácido nucleico, que puede ser ADN o ARN, rodeado por una cubierta proteica que recibe el nombre de cápsida. Hay tres tipos de cápsidas, atendiendo a su morfología: icosaédrica, helicoidal y compleja. La cubierta proteica determina la especificidad del virus; el virus sólo infecta a una célula si ese tipo de célula tiene un receptor para la proteína viral.
ADN o ARN pueden presentarse formados por una sola cadena (monocatenario) o por dos (bicatenario), y pueden ser circulares o lineales. La mayoría de los virus presenta una sola molécula de ácido nucleico, pero hay algunos que presentan varias, como el virus de la gripe.
En algunos virus como el de la gripe o el del SIDA, la cápsida esta envuelta por una membrana y se les denomina virus con envoltura, los que no la poseen se les llama virus desnudos.
Algunos virus poseen enzimas como polimerasas para fabricar su ARNm ya dentro del hospedador. Otros tienen transcriptasa inversa que permite convertir su ARN e ADN para integrarse en el genoma celular.
Clasificación de los virus: la gran variedad morfológica y estructural de los virus dificulta notablemente su clasificación. Podemos hacerlo:
Atendiendo a la forma de su cápsida.
A la presencia o ausencia de envoltura.
Al tipo de célula que parasitan (virus animales, vegetales y bacteriófagos).
Y al tipo de ácido nucleico.
La multiplicación vírica o ciclo lítico, llevado a cabo por virus virulentos, fases:
Fase de fijación o adsorción a la célula hospedadora: hay una gran especificidad en la unión entre el virus y la célula hospedadora, por la existencia de unos receptores en la membrana de la célula hospedadora.
Fase de penetración: hay diversos mecanismos dependiendo del tipo de virus y de hospedador; puede ser por simple fusión de la cubierta del virus con la membrana plasmática, en este caso sólo entraría el ácido nucleico. Puede ser también por endocitosis. Los virus desnudos suelen inyectar el ácido nucleico en el interior de la célula.Y hay virus que penetran de forma directa.
Fase de multiplicación: implica la síntesis de proteínas y la replicación del ácido nucleico.
Fase de ensamblaje: comienza una vez fabricados las proteínas de la cápsida y los ácidos nucleicos.
Fase de liberación: cuando los virus salen al exterior pudiendo lo hacer de distintas formas.
Ciclo lisogénico: virus que permanecen en estado latente en la célula hospedadora debido a que integran su ADN vírico en el ADN celular, denominándose provirus o profagos si se trata de un bacteriófago. Por ciertos estímulos externos (rayos X, radiación ultravioleta…) pueden inducir su activación provocando un ciclo lítico.
Otras formas acelulares: viroides y priones.
Viroides: descubiertos en 1967, se trata de simples fragmentos de ARNmc circular sin ningún tipo de cubierta o cápsida. Producen enfermedades en los vegetales como en la papa, en el tomate. Una infección de tiroides provoca una atrofia en el crecimiento de la planta con desarrollo normal de tallos y hojas.
Priones: son moléculas proteicas sin ningún tipo de ácido nucleico asociado al menos que se haya descubierto hasta la fecha. Producen enfermedades neurodegenerativas en mamíferos como el Scrapie o prurito lumbar de las ovejas y la encefalopatía espongiforme bobina (mal de las vacas locas). caracterizada por la aparición de abundantes huecos en el tejido cerebral.